这有一份口腔菌群研究攻略，请查收 | 微生物专题

过去上百年间人们对口腔菌群的研究主要依靠分离和培养的方法，这对微生物的发现有较大的局限性，一些丰度较低或者是不能在体外培养的微生物无法被鉴定。但随着近十年间高通量测序技术的飞速发展，人们对口腔微生物的认识日新月异。根据HOMD（人类口腔微生物组）数据库报道，近千种口腔微生物已被鉴定，包括细菌、病毒、真菌、支原体等微生物物种。

微生物组研究方法

目前微生物组的研究主要有两种测序手段：扩增子测序和宏基因组测序。扩增子测序是对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序，16S和18S rDNA是细菌和真菌中16s或18s rDNA基因的高变区，而ITS（Internal Transcribed Spacer）则是细菌、真菌和古细菌中小亚基和大亚基rRNA基因之间的间隔区DNA。这些特定的遗传物质都包括进化保守性及进化可变区。扩增子测序成本低、周期短、受宿主DNA影响小，适合用于大样本的研究。

宏基因组则是直接将生态位中所有微生物的DNA进行提取，构建宏基因组文库。宏基因组覆盖面广、精确度高（可鉴定到种）、在扩增子测序的基础上还可以进行基因和功能层面的深入研究。

微生物组（包括口腔）的研究主要包含以下几个部分：

1. 设计实验

确认收集样品类型；思考数据分类；咨询数据统计学家；联系测序服务人员

2. 样本采集

制定一个合适的采集步骤保证志愿者都能按照要求采集样品；保证采集数量充足；避免污染

3. DNA提取

避免样品间交叉污染；设计一个提取效率高的实验方案

4. 建立文库/测序

最常用Illumina MiSeq平台

5. 数据分析

过滤数据；物种注释；物种组内组间多样性分析（α分析/β分析）；确定组间差异后寻找biomarker

影响口腔菌群的因素

口腔微生物组因人而异，相对稳定，对变化具有显着的弹性。因此，为了证明具有不同疾病的个体之间的显着差异或观察治疗效果，可能需要大量受试者。另外口腔微生物组研究中收集样本和研究群体的相关信息至关重要，如果没有这些临床元数据得到的测序结果只是普通的数据，缺乏科学可靠的解释。

已知影响口腔菌群的主要因素，包括人口因素（如年龄、性别、社会经济地位（SES）），一般健康因素（如使用抗生素、系统疾病、怀孕），口腔健康因素（如口腔卫生习惯、牙龈与牙周健康、龋齿、种植牙、假牙），生活方式因素（如抽烟、饮酒、饮食），生物学因素（如宿主基因组），以及技术因素（如样本采集与保存、DNA提取、PCR引物、数据分析流程）（图1），它们都会不同程度地影响口腔菌群的分析。这些因素的详细内容如表1所示，其中应记录的最低必需信息以红色标注[1]。

图1 已知影响口腔菌群的主要因素

表1 口腔菌群研究中需要记录的样本信息

口腔菌群不同采样部位的优缺点

口腔是一个复杂的生态系统，由不同的生态位（具有不同的群落组成）构成，其中脱落（黏膜组织）和不脱落（牙齿硬组织）表面形成两个主要的、成分截然不同的生态位（图2）[1]。除了这些与组织相关的差异，还有一个由唾液流动形成的从嘴巴前部到后部的空间梯度。因此，代表整个生态系统的通用“口腔菌群”样本并不存在。

目前，口腔菌群研究的样本类型主要包括唾液、牙面菌斑、龋损菌斑、龈下菌斑、种植体周黏膜下菌斑、根管内菌斑、舌背菌斑及其他黏膜表面菌斑样本。这些样本的采集方式在之前的推文中有详细解释（点击蓝字可直达链接）

不同的采样方式有各自的优点和局限性（表2）[1]。考虑到取样的便利性，唾液和舌苔拭子常被作为研究口腔菌群的样本来源。

图2 HMP收集的9种不同口咽样本中，细菌组成之间存在显著的跨生态位相关性。

表2 口腔菌群研究中主要样本类型的优缺点

参考文献

1. Zaura E, Pappalardo VY, Buijs MJ, Volgenant CMC, Brandt BW. Optimizing the quality of clinical studies on oral microbiome: A practical guide for planning, performing, and reporting. Periodontol 2000. 2021;85(1):210-236.

2. Wade WG, Prosdocimi EM. Profiling of Oral Bacterial Communities. J Dent Res. 2020;99(6):621-629.

3. Zaura E, Brandt BW, Teixeira de Mattos MJ, et al. Same Exposure but Two Radically Different Responses to Antibiotics: Resilience of the Salivary Microbiome versus Long-Term Microbial Shifts in Feces. mBio. 2015;6(6):e01693-15. Published 2015 Nov 10.

4. Rosier BT, Marsh PD, Mira A. Resilience of the Oral Microbiota in Health: Mechanisms That Prevent Dysbiosis. J Dent Res. 2018;97(4):371-380.

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